浅谈SMA基因检测技术

什么是脊肌萎缩症？

脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA），是一种常见的致死性神经肌肉改变疾病，其以进行性、对称性的肌无力、肌萎缩作为主要临床特点，近侧端肌肉受累较远侧端肌肉严重，下肢肌肉受累较上肢肌肉严重，目前尚无经济的治疗方法。

SMA 作为常染色体隐性疾病中最为常见的致死性疾病之一，在中国人群的携带率约为1/62，在世界范围的携带率约为1/40，总体发病率为1/6000-1/10000。目前遗传学已经确认，SMA主要与两个高度同源的基因密切相关，SMN1与SMN2，这两个基因主要是通过7号外显子和8号外显子上的两个基因位点进行区分。

图片来源于Qu YJ et al, PMID: 27425821, J Mol Diagn,2016

正常情况下每个人都拥有2份拷贝的SMN1基因。约 95%的SMA患者是由SMN1基因外显子7和外显子8 的纯合缺失所致，约5％个体表现为复合杂合变异（一个等位基因缺失，另一个点突变）。而SMN2基因突变本身并不致病，其仅有10-20％能正常表达，但SMN2作为SMA表型的修饰基因，其拷贝数量的多少与SMA患者表型的轻重有关，SMN2的拷贝数量越多，SMA患者的表型越轻。根据SMN2拷贝数的不同以及发病年龄等，SMA在临床上主要分为4种类型。

在基因诊断普及之前，临床对SMA的诊断多靠询问病史、临床体征配合肌电图等辅助检查进行综合分析，这些诊断方法均存在有较高的误诊及漏诊之可能，而肌肉活检等诊断方法作为诊断 SMA 的金标准，也仍存在操作复杂、创伤性较大等缺点。近年来，随着基因诊断的不断完善，基因诊断逐渐取代肌肉活检成为诊断SMA的金标准。但市面上基因诊断方式多样繁杂，选择何种方式才能达到最经济、准确及快速呢？我们先来看一下常见SMA基因诊断方式及其特点。

SMA的基因诊断方式

聚合酶链反应 － 限制性片段长度多态性分析

聚合酶链反应 － 限制性片段长度多态性分析( polymerase chain reaction － restriction fragment length polymorphism，PCR － RFLP)是最经典的SMA基因诊断方法，PCR － RFLP 诊断 SMA 原理是利用 SMN1 和 SMN2 基因外显子碱基差异所导致的限制性内切酶位点不同，酶切后产生电泳条带的数量和大小发生改变。但PCR-PFLP只能检测 SMN1基因外显子 7 和( 或) 外显子 8 纯合缺失，不能判断杂合缺失，也就是说该方法只能区分正常人和发病者，不能对 SMA 致病基因携带者进行诊断，且PCR-RFLP还有对DNA 模板含量 要求较高，对实验人员要求较高、结果判读困难等局限，因此PCR-RFLP不适合作为基因诊断的首选。

多重连接探针扩增技术

多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）是一种高通量、针对待测核酸靶序列进行定性和半定量的分析技术，是目前常规采用的基因诊断方法。MLPA具有准确度高、特异性强的特点，不仅可以区分正常人、患者和携带者，还可以检测患者的SMN2拷贝数。但同时MLPA也存在着操作流程复杂、实验耗费时间较长、实验结果判读相对复杂，商品化试剂价格高昂的局限，会给普通家庭造成不必要的经济和心理负担，因此尚不适用于人群中的携带者筛查。

荧光定量PCR

荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）诊断SMA的主要原理是通过两个多重实时荧光定量PCR反应，以单拷贝RPP40基因为内标基因，采用MGB-Taqman探针法分别对SMN1基因第7和第8外显子进行拷贝数相对定量，来判断是否发生缺失或转换。荧光定量PCR局限性为无法检测出SMN1点突变和2+0基因型携带者，优势为不仅可以区分正常人、患者和携带者，还具有成本低廉、实验快速准确、操作简便、实验流程不易被污染、结果判读直观等，相比起PCR-RFLP与MLPA来说，其更符合产前诊断经济、简便、容易实现且性价比较高、统一且易推广的特性，也更适合作为大规模人群中开展SMA携带者筛查的技术。

SMA基因诊断的常用方式有很多，通过对比可以发现，每个检测方式都有自己的优势和弊端，选择最合适自己的才是最好的。

参考文献:

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